癌癥是威脅人類健康的重大疾病之一，有效的腫瘤治療是降低死亡率的關(guān)鍵。在眾多腫瘤治療新方法中，光動力療法 (photodynamic therapy，PDT) 是一種潛力的治療惡性腫瘤的新技術(shù)。其原理是用特定波長的光激發(fā)聚集在腫瘤部位的光敏劑產(chǎn)生活性氧，殺傷腫瘤細(xì)胞。與傳統(tǒng)的手術(shù)切除、化療、放療等腫瘤治療方法相比，光動力治療具有非侵入性、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤科、眼科和皮膚科等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

　　光的穿透深度和光敏劑的亞細(xì)胞定位是決定光動力治療效果的兩個(gè)重要因素。幾乎所有光敏劑的吸收波長都位于可見光波段，而可見光在生物組織中的穿透深度非常有限，因此光動力療法在臨床中主要用于淺表疾病的治療;但是，深層腫瘤組織的光動力治療仍是基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用需要攻克的技術(shù)難題。多光子激發(fā)是解決這一難題的重要手段，用于多光子激發(fā)的近紅外光具有更大的穿透深度，可以有效提高治療深度。

　　此外，由于活性氧的平均壽命和作用距離都非常短，因此光敏劑在細(xì)胞中的分布決定了原發(fā)損傷位點(diǎn)，并進(jìn)而啟動各種細(xì)胞信號通路，產(chǎn)生多種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。大部分細(xì)胞器靶向的PDT研究已經(jīng)非常充分且深入，然而核仁如同一個(gè)研究“黑箱"，等待著更進(jìn)一步的探索。課題組前期的研究表明核仁是一個(gè)十分理想的腫瘤治療靶點(diǎn)，具有更低的副作用和更好的療效等優(yōu)勢，但核仁靶向雙光子PDT目前幾乎處于未知的狀態(tài)。

　　核仁靶向療法，具有優(yōu)異的治療效果

　　為了解決以上兩點(diǎn)問題，上海交通大學(xué)顧波波副教授課題組對基于核仁靶向碳點(diǎn)的雙光子光動力療法進(jìn)行了研究。首先以檸檬酸和乙二胺為原材料，通過簡單的微波加熱法合成了一種兼具核仁靶向能力和活性氧產(chǎn)生能力的碳點(diǎn)作為光敏劑。然后基于奧林巴斯顯微系統(tǒng)(OLYMPUS FLUOVIEW FVMPE-RS)和飛秒激光器(Coherent Ultra II)，搭建了用于雙光子光動力治療及療效評估的光學(xué)系統(tǒng)，并用人源宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞研究了腫瘤細(xì)胞雙光子光動力治療的療效，證明了核仁靶向的雙光子光動力療法具有優(yōu)異的治療效果。

　　為了研究碳點(diǎn)的細(xì)胞內(nèi)定位，選用一種商用的核仁成像探針SYTO RNASelect和碳點(diǎn)共同標(biāo)記HeLa細(xì)胞，結(jié)果如圖1所示。碳點(diǎn)的熒光信號與SYTO RNASelect的熒光信號重疊，這表明本文中合成的碳點(diǎn)可以有效靶向到核仁。與其他核仁靶向光敏劑相比，該碳點(diǎn)的優(yōu)勢在于無需使用核仁靶向納米顆粒載體或者在表面修飾核定位信號分子，具有合成簡易、結(jié)構(gòu)簡單、性能穩(wěn)定等優(yōu)勢。

　　圖1 碳點(diǎn)與RNAselect共染Hela細(xì)胞的熒光圖像、疊加圖像及明場圖像。碳點(diǎn)通道(Ex: 552 nm, Em: 560-590 nm)，RNASelect通道(Ex: 488 nm, Em: 510-540 nm)，[RNASelect] = 10 μm, [C-dots] = 500 μg/mL

　　隨后在不同光照條件下對HeLa細(xì)胞進(jìn)行雙光子光動力治療，并使用熒光成像方法進(jìn)行療效評估。將HeLa細(xì)胞與碳點(diǎn)(500 μg/mL)共孵育3小時(shí)，再用飛秒激光(740 nm，28 mW)對碳點(diǎn)標(biāo)記的HeLa細(xì)胞進(jìn)行光照。在不同時(shí)間的光照后，選用Calcein-AM和PI對治療后的HeLa細(xì)胞染色，并通過熒光成像方法評估治療效果。如圖2所示，在飛秒激光掃描的區(qū)域，隨著掃描時(shí)間的增加，更多的細(xì)胞呈PI陽性，即壞死。

　　當(dāng)掃描時(shí)間增加到45 s時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞都壞死。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見核仁靶向PDT通過原位產(chǎn)生的ROS破壞癌細(xì)胞核仁中的RNA，從而達(dá)到優(yōu)異的抗腫瘤效果。而飛秒激光掃描區(qū)域外都顯示Calcein綠色熒光，也證明碳點(diǎn)良好的生物相容性。同時(shí)，僅用飛秒激光掃描的HeLa細(xì)胞(740 nm，28 mW，3 min)也顯示Calcein綠色熒光，從而排除飛秒激光掃描對治療效果可能產(chǎn)生的影響。

　　圖2 核仁靶向雙光子光動力療法引起細(xì)胞壞死。HeLa細(xì)胞與碳點(diǎn)孵育后/HeLa細(xì)胞經(jīng)過不同時(shí)間的雙光子掃描。Calcein 通道(Ex: 488 nm; Em: 505-525 nm)，propidium iodide (PI)通道(Ex: 532 nm; Em: 605-625 nm)

　　本研究設(shè)計(jì)并合成了兼具核仁靶向能力和ROS產(chǎn)生能力的新型碳點(diǎn)，具有良好的生物相容性和快速代謝等優(yōu)勢，可以在癌細(xì)胞核仁處產(chǎn)生ROS，從而在低劑量光照和光敏劑的條件下，實(shí)現(xiàn)有效的腫瘤細(xì)胞光動力治療。同時(shí)該碳點(diǎn)具有雙光子吸收能力，可以通過非線性過程被雙光子激發(fā)從而獲得更大的穿透深度，有利于深層腫瘤的治療。因此，基于碳點(diǎn)的核仁靶向雙光子光動力療法在未來的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中具有巨大潛力。

　　參考文獻(xiàn)： 中國光學(xué)期刊網(wǎng)

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